De tweekleurige vleermuis is een middelgrote en opvallend gekleurde vleermuis: de rugvacht is bijna zwart met zilverwitte, ‘berijpte’ haarpunten en de buik is lichtgrijs. Jonge dieren hebben een lichtbruine, adulten een grijswitte tot geelachtige kraag. De kop is gedrongen, de snuit en oren zwart. De tragus is kort en breed. De kop-romplengte bedraagt tot 64 mm, de spanwijdte tot 33 cm, het gewicht tot 23 g (Schober & Grimmberger 1998). Met de lange smalle vleugels is de soort aangepast aan een hoge vliegsnelheid in open ruimte (Baagøe 1987). De echolocatie lijkt veel op die van rosse vleermuis, bosvleermuis, laatvlieger en noordse vleermuis. Het is de enige soort in West-Europa die regelmatig twee jongen krijgt (Dietz et al. 2011).